答:Miseq PE300平臺測序長度為600bp，但其測序質量較差，質控需要過濾掉超過100bp質量較差的序列；Hiseq2500 PE250平臺測序質量較好，但測序總長度為500bp，去掉12bp的barcode和部分質量較差的序列之后只剩460bp左右。所以保守起見，擴增子片段長度不能超過460bp，否則雙端測序結果將無法進行拼接，在引物選擇時應引起注意。

答:DGGE等分子指紋圖譜技術，在其實驗結果中往往只含有數十條條帶，只能反映出樣品中的優勢種群，需要標準菌株，且受到凝膠電泳特性的局限，無法檢測到稀有菌群的種類，因此其重復性和分辨率都不甚理想。而高通量測序技術能同時對樣品中的優勢種群及微量菌進行檢測，獲得樣品中的微生物群落組成，并將其含量進行數字化。

答:擴增子主要分為16S、18S、ITS等測序，關注環境樣本中的物種組成，該技術物美價廉，實用性高。宏基因組關注環境樣本中的物種組成、功能組成及代謝通路等信息，該技術深入挖掘環境樣本功能層面的信息。

答:為了數據質量、結果產出及順利投稿，必須注意生物學重復問題?？紤]到個體差異，后期組間統計學分析以及偏離樣本，自然環境至少3個生物學重復，推薦5個；若是人類的腸道、糞便等樣品，由于個體特異性高，建議10個以上的重復。

答:ITS測序主要是針對真菌多樣性的研究，注釋準確度高；18S測序針對的是真核微生物，注釋到的范圍廣，但是就真菌來說精確度相對較低；可根據研究目的合理選擇測序方案。

答:針對環境樣本推薦老師采用常規的CTAB法或SDS法；其中人和動物組織樣本使用SDS方法，其他樣本采用CTAB法。另外，針對一些較難提取的樣本或您希望提高樣品DNA的提取效果，推薦使用Mobio公司專門的環境樣本DNA提取試劑盒。

答:Unidentified：分類學比對時在設定的置信閾值以下或沒有分類信息的reads；Unclassified：在數據庫中沒有找到對應于該序列的分類信息；Others：注釋到多個數據庫的reads；此處應注意，物種相對豐度分布圖中的Others則包含上述三種注釋結果及相對豐度小于1%的物種。g_和s_是數據庫中在屬和種水平有對應的序列信息，但是沒有注釋信息，f_Legionellaceae是數據庫中在屬和種水平沒有對應的序列信息。

答:不同的樣品的序列數不同，為了排除因樣本間測序數目不同而引入的誤差，所以以序列數最低的樣品為標準，對不同樣品進行重抽樣，使各樣品的序列數在同一水平下進行樣品間的比較分析。

答:直接用相對豐度值進行熱圖的繪制，常常會由于聚類結果中出現相對豐度值分布不均勻，導致大部分豐度較低的物種呈現相同或相近的顏色，不利于樣品及物種間的比較分析，因此我們在繪制之前對數值進行了標準化，即對每一個豐度排在前30的物種單獨進行z-Score并取自然對數后繪制熱圖。

答:Alpha多樣性即樣品內部的生物多樣性，跟其他樣品無關，但不同的樣品之間亦可以進行數值上的比較（在序列數目一致的前提下）。Alpha多樣性根據OTU table和系統發育樹進行計算，通常計算的參數包括 observed species指數（OTUs）、chao1指數、shannon指數、simpson指數以及PD whole tree，其中observed species指數和chao1指數反映樣品中群落的豐富度，即簡單指群落中物種的數量（OTU數目），而不考慮群落中每個物種的豐度情況，數值越大，說明樣品中物種越豐富；shannon指數、simpson指數以及PD whole tree反映群落的多樣性，受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響，shannon、simpson指數以及PD whole tree的值越大，說明樣品群落多樣性越高。