微生物組學

MICROBIAL GENOMICS
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原核鏈特異性轉錄組測序

Sequencing of primary chain specific transcriptome

產品介紹

細菌轉錄組通過與相應的基因組進行map分析,揭示其中轉錄活性較高的相關基因及其功能。一般而言,單菌轉錄組具有不同的梯度的實驗設計(如不同溫度,不同添加物濃度等等),所以會有多個轉錄組進行比較分析,從而揭示與研究的功能(表象)具有一定聯系的基因(簇)或代謝途徑(機制)。

產品優勢


  • 成熟穩定的實驗技術

    成熟、穩定的實驗流程保障實驗結果的可重復性


  • 針對性實驗

    根據不同材料選取最適試劑盒去除rRNA,保證數據量


  • 數據深入分析

    擅長細菌轉錄組的個性化分析,深入挖掘創新性成果

實驗流程

RNA提取檢測
去除rRNA
構建鏈特異性文庫
文庫質檢
上機測序

分析流程

樣品要求


  • 菌體樣品

    原核鏈特異性轉錄組暫時不接受菌體樣品。


  • RNA樣品

    濃度≥65ng/μl,總量≥3μg(單次建庫),OD260/280介于1.8~2.2之間,OD260/280≥1.8,RIN值≥6.0,23S:16S≥1.0,確保RNA無降解。


  • 樣品保存運輸

    RNA樣品可溶于RNA-free的超純水中,-80°C保存。樣品保存期間避免反復凍融。樣品置于1.5 mL管中,封口膜封好,干冰運輸。

技術參數

測試策略 數據量 周期
HiSeq PE150 1G/2G 45個工作日
  • 原核轉錄組去除核糖體RNA 效率如何?

    答:目前針對原始生物轉錄組測序,根據物種的具體情況我們會采用Illumina核糖體RNA去除試劑盒進行rRNA去除,這些試劑盒的rRNA去除效率一般都在98%以上。

  • 原核生物沒有參考基因組能做轉錄組測序嗎?

    答:對于原核生物來說,由于其多順反子的結構。如果從頭拼接,無法確定基因的起始終止位置,必須有參考基因組提供位置信息。建議先做一個基因組掃描,用來作為參考。

  • 原核生物可以做sRNA的分析嗎?

    答:可以。美格基因原核轉錄組產品的標準分析中就包含sRNA的分析,包括sRNA的表達水平分析及結構水平分析。

  • 原核轉錄組測序需要多少數據量?

    答:對原核生物轉錄組,推薦采用3-4Gb clean data進行后續分析。對于轉錄組一般不說測序深度多少X,測序深度專門針對基因組測序或重測序而言,轉錄是個高度復雜的過程,某個組織或時期下,并不是所有基因都表達,這些基因的表達與否和表達豐度都是高度變化的。


Reads在染色體上的密度分布情況

最外圈是基因組;中間的灰色背景區是實際的抽取的reads的分布情況,紅色mapping到正鏈,藍色到負鏈;最里面的圓圈,橘黃色為正鏈coverage分布,綠色為負鏈coverage分布。


差異基因KEGG富集分析

打開web的鏈接,得到每個通路圖及差異基因的標注,紅色方框表示差異基因。


橫軸:Rich factor指差異表達的基因中位于該pathway條目的基因數目與所有有注釋基因中位于該pathway條目的基因總數的比值,Rich factor值越大表示富集程度越高;圓點越大此pathway中候選靶基因個數越多,而點的顏色對應于不同的Pvalue范圍??v軸:pathway名稱。


差異基因GO富集分析

通過GO注釋結果我們對GO做富集分析,通過富集分析我們可以看到差異基因主要富集的Term。GO分析對實驗結果有提示的作用,通過差異基因的GO 分析,可以找到差異基因的GO分類條目,尋找差異基因可能和哪些生物學功能顯著相關。


每個節點代表一個GO術語,方框代表的是富集程度為TOP10的GO, 顏色的深淺代表富集程度,顏色越深就表示富集程度越高,每個節點上展示了該TERM的名稱及富集分析的P-value。


UTR預測和長度分布分析

根據基因轉錄起始位點(轉錄終止位點)和翻譯起始位點(翻譯終止位點)信息,提取5'UTR(3'UTR)序列,并對其長度分布情況進行統計。針對5’UTR,用RBSfinder軟件對SD序列進行預測(其中,rbs region length我們設為50bps);針對3’UTR,用TransTermHP軟件對不依賴σ因子的終止子進行預測。


sRNA分析

細菌中,長度在50~500nt的非編碼RNA通常定義為小RNA(small RNA, sRNA)。用Rockhopper軟件發現新的基因間區轉錄本,通過Blastx與nr庫作比對,對新預測的轉本區域進行注釋,將注釋不上的轉錄本作為候選的非編碼sRNA。通過RNAfold軟件和IntaRNA軟件對候選的sRNA分別進行二級結構預測和靶基因預測。

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